Junk DNA en de uientest

Dit blogbericht werd voorafgegaan door vier (1, 2, 3, 4) blogberichten over ENCODE: de encyclopedie van DNA-elementen, waarin aan zeker 80% van het DNA een functie toebedeeld werd. Er ontstond veel ophef over dit hoge percentage en het bleek dat ‘functioneel’ een erg ruim begrip was. De belangrijkste groep functionele elementen zijn natuurlijk allereerst de genen die als RNA afgelezen worden en vervolgens vertaald worden in proteïnen. Een andere groep was het DNA dat als RNA afgelezen werd maar dat niet voor proteïnen codeerde. Een derde groep waren de DNA sequenties die min of meer specifiek gebonden werden door transcriptiefactoren. Ook in het geval van een zwakke en aspecifieke binding werd er gesproken van functionele elementen. De rest, 20%, bestond uit junk DNA, dat voornamelijk gevormd werd door transposons en pseudogenen ofwel inactieve overblijfselen van virussen.

Dit is de situatie zoals die door ENCODE voorgesteld werd met de publicatie van de resultaten op 5 september van dit jaar. Voor die tijd wist men dat het functionele DNA bestond uit coderende genen en genen die RNA produceerden dat een mogelijke rol had in de regulering van de transcriptie zelf en in andere regulerende processen. In de tijd die voorafging aan ENCODE besloeg het functionele DNA iets meer dan de hoeveelheid coderende genen. Zonder dat daar ooit precies onderzoek naar gedaan was ging men er van uit dat veel DNA, tenminste zo’n 90 % junk was in plaats van de 20% die er met ENCODE overbleven.

Genoomgrootte. Let op de enorme afmetingen bij planten en amfibien.

Er werd door veel wetenschappers geprotesteerd tegen dit hoge percentage functioneel DNA maar vooral tegen dit lage percentage junk DNA. Ewan Birney, een van de leiders van het project ENCODE, werd aangeraden de ‘onion test‘ te heroverwegen. In de ‘onion test’ wordt er herinnerd aan het feit dat er organismen zijn die een genoom bezitten dat veel groter is dan het onze, zoals de ui of de salamander die een genoom hebben dat wel 10 tot 20 keer groter is. Dit zijn niet bijzonder complexe organismen waardoor het onduidelijk is wat deze met zo’n groot genoom doen. Dit verschil wordt des te moeilijker te verklaren wanneer het grootste deel van dit DNA functioneel zou zijn. Alleen met het uitgangspunt dat het grootste deel van het genoom hoe dan ook junk is, wordt het functionele gedeelte van het DNA vergelijkbaar tussen de verschillende soorten organismen. Het genoom moet dus wel voornamelijk uit junk bestaan. Alleen in dat geval is het functionele deel ongeveer van dezelfde afmeting in alle soorten organismen.

Dit is eigenlijk een ander argument dan dat van de uitvinder van de ‘onion test’ Ryan Gregory zelf die het probleem als volgt stelde: “Can I explain why an onion needs about five times more non-coding DNA for this function than a human?” als vraag aan degene die dacht een functie gevonden te hebben voor junk DNA. Een erg goede vraag omdat je zoiets zeker nooit verklaren kunt hetgeen betekent dat het grootste deel van het genoom wel junk moet zijn.

Uit: The Curious Wavefunction

Vandaag werd bekend dat de Nobelprijs geneeskunde gegaan is naar John Gurdon en Shinya Yamanaka voor hun onderzoek op stamcellen. Er staan twee uitgebreide artikelen in de Volkskrant en in de NRC. Wie nog meer wil weten over details van het onderzoek van Yamanaka kan mijn blog over de problemen met zijn methode in verband met epigenetische factoren hier lezen en er een mooi filmpje bekijken over het belang van deze methode.

 

 

Een rol voor junk DNA

De twee voorgaande blogberichten (1, 2) gaan over het project ENCODE. Deze Encyclopedie van DNA-elementen, die afgelopen week vrijkwam, laat zien dat het DNA dat tot dan toe als ‘junk’ werd beschouwd toch voor een bijzonder groot deel ‘functioneel’ is. Men had het over paradigm-shift en Kuhniaanse revoluties, maar langzaamaan worden de resultaten van het onderzoek wat gerelativeerd. Er zijn nog steeds kranten die het nieuws op sensationele wijze brengen, maar de blogs van de verschillende geïnteresseerde wetenschappers laten zien dat het een kwestie is van goed definiëren wat ‘junk’ is en wat er onder ‘functioneel’ verstaan moet worden.

Een artistieke weergave van junk DNA

Het DNA van ons genoom bevat circa 1,5% genen die voor eiwitten coderen. De rest van het DNA (98,5%) werd door sommigen als ‘junk’ bestempeld en gezien als DNA zonder enige rol of functie. Toch wist men dat het zogenaamde ‘junk’ DNA veel sequenties bevatten die belangrijk zijn voor de regulatie van de expressie van de genen. Het ‘junk’ DNA omvat dus eigenlijk minder dan 98,5% van het totale genoom. Eigenlijk moet er gesproken worden van 98,5% niet-coderend DNA dat bestaat uit regulerende sequenties, junk DNA en DNA met onbekende functie. Junk DNA is daarom niet synoniem aan niet-coderend DNA.
ENCODE liet zien dat 80 % van ons DNA bestaat uit ‘functionele’ elementen. Het echte junk DNA zou dan slechts 20 % zijn. Voor velen kwam deze verschuiving van 1,5%-98,5% naar 80%-20% als een harde klap. Maar de meeste wetenschappers realiseerden zich dat de definitie van ‘functionele’ elementen wel erg breed is. Alles dat ‘biochemisch’ actief is wordt er toe gerekend. Strikt genomen zou dan het hele genoom ofwel 100% functioneel kunnen zijn, aangezien al het DNA tijdens replicatie door polymerasen ‘gelezen’ wordt. Transposons, die zelf repliceren en zich verplaatsen in het genoom, behoren tot het ‘junk’ DNA, maar kunnen wel als functioneel gezien worden zodra zij terecht komen in een actief gen. Eigenlijk is het experiment ENCODE niet goed opgezet. Er bestaat namelijk geen nulhypothese. Men zou kunstmatig DNA ter grootte van een chromosoom moeten creëren waarvan de sequentie random is en dit onderwerpen aan het ENCODE experiment. Het spreekt vanzelf dat er dan altijd wel ergens een sequentie bestaat die een regulerende functie lijkt te hebben omdat transcriptiefactoren zich daar aan het DNA binden.

Nu zou de definitie van ‘junk’ DNA kunnen zijn, ‘niet-functioneel, ‘zonder rol, of ‘niet essentieel’. Dat laatste zou betekenen dat ‘junk’ DNA zomaar weggelaten of weggehaald kan worden, zonder dat het organisme daar fenotypisch door verandert. Het is op dit punt van belang zich te realiseren dat er organismen zijn met een genoom dat qua grootte 3 keer dat van ons mensen is. Een voorbeeld is de ui. Deze plant heeft een enorme hoeveelheid DNA. Zou ook de ui door een project als ENCODE onderzocht moeten worden en zou dan ook blijken dat er ‘slechts’ 20% junk is ?. Het is daarom niet juist te spreken van de ‘Onion Test’ die alleen maar kijkt naar de enorme hoeveelheid DNA en niet naar het percentage junk. Een ander organisme is de kogelvis. Dit dier heeft een bijzonder klein genoom en daarom ook erg weinig ‘junk’ DNA. Dit dier wordt gezien als het bewijs voor het feit dat ‘junk’ nauwelijks of geen rol zou hebben. Helaas kan ik hier, net als voor de ui, niet bepalen of er gekeken wordt naar het percentage ‘junk’ DNA.
Toch is het mogelijk een belangrijke rol en wellicht zelfs een functie aan het junk DNA te verbinden. Het zou een mechanische rol kunnen hebben in de stabilisatie van de driedimensionale structuur van de chromosomen. Het zou de dynamica van het transcriptie-proces kunnen beïnvloeden. De transcriptie van genen kan immers langer duren als er zich een transposon in bevindt. Het is ook mogelijk dat ‘junk’ als eiwitbindend DNA beschouwd moet worden. Het onttrekt eiwitten aan de rest van het DNA. Zou je dit junk weghalen dan zouden deze transcriptiefactoren zich in hoge concentratie op het overgebleven ‘functionele’ DNA werpen. In embryo’s van fruitvliegjes is het mogelijk een mechanisme te bespeuren waarin ‘junk’ DNA de transcriptieduur van bepaalde genen bepaalt.
Dat er gezonde organismen als de kogelvis zijn die vrijwel zonder ‘junk’ DNA kunnen leven is op zich niet verrassend. Ze bezitten een mechanisme waarmee inserties van transposons meteen weggeknipt worden. Het ontstaan van nieuwe kopieën van transposons wordt precies gecompenseerd door dit mechanisme waardoor er geen extra ‘junk’ DNA gevormd wordt. Het spreekt vanzelf dat dit organisme geëvolueerd is met deze eigenschappen en dat die kleine hoeveelheid junk DNA een kenmerk is van deze vis. Maar ook hier zou men zich kunnen afvragen wat het percentage van ‘junk’ DNA in de vis eigenlijk precies is volgens de normen van ENCODE.
Het zal nog wel even duren voordat het genoom van de ui en de kogelvis precies ontleed wordt. Ondertussen gaat de discussie over het project ENCODE voort met elke dag wel een nieuwe update van een blogger ergens uit de blogosfeer.

Uit: Sean Eddy’s blog and the Onion test.

h/t  to Rob van der Vlugt

Retrotransposons in het embryo

In een onlangs verschenen onderzoek in Nature wordt beschreven hoe de methylatie van het DNA verloopt rondom de vorming van de bevruchte eicel of zygote. Methylatie van DNA is een mechanisme om genen te onderdrukken of juist tot expressie te laten komen wanneer methylatie ontbreekt. Dit wordt ook wel epigenetische silencing genoemd. Het heeft een belangrijke rol in de differentiatie van cellen. Elke cel in ons lichaam bevat het complete genoom, maar in een spiercel en een zenuwcel komen geheel andere genen tot uitdrukking. Dit hangt voor een belangrijk deel af van de mate waarin de genen gemethyleerd zijn.

Het blijkt nu dat er tijdens de vorming van het embryo verschillen zijn in de graad van methylatie. Deze is bijzonder laag rond de vorming van de blastocyst, het tweede meercellige stadium van het organisme (in dit geval van de muis), waarin de cellen pluripotent zijn oftewel differentieerbaar zijn in alle verschillende weefsels. Het DNA is een sequentie bestaand uit vier letters of basen: adenine, thymine, cytosine en guanine. De volgorde van deze letters vormen de code van het DNA. Bij methylatie wordt op een van de vier basen (op cytosine) een methylgroep aangebracht wanneer er een guanine op volgt ofwel op een CpG site.

Uit Wikipedia: van ei- en zaadcel tot blastocyst

Bij de vorming van het embryo zijn de eerste cellen niet gedifferentieerd; het eerste stadium van de morula bestaat uit totipotente stamcellen en in de blastocyst zijn de cellen pluripotent. In dat laatste stadium is de methylatie erg laag. De studie laat ook zien dat het vooral bepaalde retrotransposons of Transposable Elements (TE’s) zijn die een minimum aan methylatie bereiken in dit stadium. Deze genetische silencing onderdrukt normaal ook het verspringen van de retrotransposons. Het voorgaande blog bespreekt uitgebreid wat retrotransposons precies zijn. Ze springen door het genoom en kunnen midden in een gen belanden en het daardoor verstoren of zelfs kapot maken. Het is goed voorstelbaar dat de retrotransposons makkelijker zullen verspringen in deze ongemethyleerde vorm. Of dit ook werkelijk het geval is is niet onderzocht. Dit zou betekenen dat er een grote kans is op schadelijke mutaties in het genoom. Bijna 50 % van het genoom bestaat uit retrotransposons, dus eventuele inserties zullen daar weinig schade aanrichten, maar in ongeveer 25 % van het genoom, dat coderend is, zullen er problemen kunnen ontstaan. De vraag is dan hoe het mogelijk is dat deze retrotransposons zo slecht gemethyleerd zijn. Het gaat hier om specifieke retrotransposons namelijk L1’s. In het artikel wordt hier geen conclusie aan verbonden. Zou het kunnen dat hun gespring een specifieke en zelfs positieve rol heeft ?
In de reacties op het blog van Gert Korthof over de Alu retrotransposons wordt door Gert zelf geopperd dat sommige transcripten van transposons wel degelijk een (positieve) functie kunnen hebben en dat dat de rede is dat ons genoom er zo vol mee zit.

Mozaicisme

De lage methylatie en het verspringen betekent niet alleen een toename van de kopieën, maar ook een toegenomen transcriptie. In het menselijk genoom betekent een verhoogde expressie van L1 een toename in inserties van Alu. Dit soort inserties hebben voornamelijk plaats in de blastocyst ofwel in de pluripotente cellen en niet in de geslachtscellen. Er vormt zich daardoor een groter mozaïek in de somatische cellen en er ontstaat mozaïcisme.

Wetenschappers vragen zich nu af of TE’s niet zelf een rol hebben in epigenetische silencing. Er wordt ook gedacht dat TE’s een drijvende kracht kunnen vormen achter evolutie omdat ze zorgen voor translocatie van seqeunties en omdat ze exons door elkaar kunnen schudden en de reparatie van dubbelstrengse breuken in het DNA kunnen bevorderen. Inserties en transposities kunnen regulerende genen beïnvloeden en zo het fenotype veranderen.

De capaciteit van transposons om genetische diversiteit te doen toenemen, samen met de mogelijkheid van het genoom om het grootste deel van de TE activiteit te onderdrukken, resulteert in een evenwicht dat transposons een rol toebedeelt in de evolutie en genoom regulatie in alle organismen die deze sequenties bezitten.

Uit Nature, Mol. Cell Biology, Scitable.

Met dank voor het artikel uit Nature aan Gert Korthof en voor de discussie aan alle reageerders op mijn voorgaande blogbericht.

Retrotransposons en de evolutie van het menselijk genoom

Na de voltooiing van het HGP (Human Genome Project) werd duidelijk dat bijna de helft van ons genoom bestaat uit jumping genes of transposable elements (TE’s). Dit zijn stukjes DNA die, zoals de naam al aangeeft, binnen het genoom kunnen verspringen. Dit kan gebeuren door eenvoudigweg een ‘cut and paste’ zoals in het geval van DNA-transposons of door ‘copy and paste’ zoals in het geval van retrotransposons. Vooralsnog zijn deze elementen geen functie toebedeeld en werden ze tot voor kort beschouwd als junk-DNA. Daar komt nu langzamerhand verandering in, want deze elementen hebben een grote invloed gehad op de evolutie van het menselijk genoom.

Een transposon verplaatst zich in het genoom

Retrotransposons verplaatsen zich door een RNA-kopie van het eigen DNA te maken. Deze RNA-kopie wordt vervolgens weer in DNA omgezet, net zoals bij retrovirussen waaronder HIV, waarna dit stukje op een andere plek in het genoom teruggeplaatst wordt. Er zijn drie verschillende soorten retrotransposons: de LINE-1’s, de SVE’s en de Alu’s. Dit blogbericht concentreert zich vooral op de LINE-1’s of L1’s.

Dat het genoom voor bijna 50% uit retrotransposons bestaat is waarschijnlijk een onderschatting aangezien veel oude TE’s enorm veranderd zijn en daarmee onherkenbaar zijn geworden. Om een idee te krijgen van de omvang van dit springende DNA, moet men bedenken dat het coderende deel van het DNA dat wij doorgaans als genen beschouwen, slechts 1,5 % vormt van het hele genoom. Het genoom zit dus vol met TE’s. Van de L1’s bestaan er wel 500.000 in ons genoom, maar slechts 100 kopien zijn functioneel. Daarvan zijn er 6 die ‘hot L1’s’ worden genoemd aangezien ze verantwoordelijk zijn voor de meerderheid van de retrotransposities van L1’s. De L1 worden ingedeeld in families naar gelang de overeenkomsten in hun sequenties. Het is daarbij aangetoond dat ze een afstammingslijn hebben die teruggaat naar 40 miljoen jaar geleden.

De verhoudingen van de verschillende retrotransposons binnen het hele genoom

Als de TE’s verspringen kunnen ze veel schade aanrichten in het coderende en regulerende genoom. Ze kunnen midden in een gen belanden en het daarmee ontwrichten. Ook regulerende sequenties kunnen kapot gaan waardoor een gen meer of minder eiwit produceert. De TE kan ook de functie van een regulerend gen bepalen of deleties veroorzaken. Zo bestaat er een hele waslijst aan mutaties die door TE’s veroorzaakt worden. Als gevolg van deze mutaties kunnen er ziekten ontstaan zoals hemofilie, taaislijmziekte, de ziekte van Duchenne en vele andere ziekten. Zo op het eerste gezicht lijkt het er dus op dat TE’s ziekten veroorzaken. Omdat TE’s toch zo overvloedig aanwezig zijn in het genoom kunnen ze niet alleen maar schadelijk zijn, ze zouden immers het organisme waar ze deel van uit maken doen sterven.

De frequentie van het springen van de genen ligt rond 1 insertie per 20 geboortes voor de Alu sequenties. Voor L1 ligt deze frequentie ook rond 1 per 20 geboortes wanneer deze schatting gebaseerd is op ziekteverwekkende inserties, maar is 1 op de 200 wanneer er een vergelijking wordt gemaakt met het chimpansee. Dit laatste gegeven wordt wel verklaard met een sterke selectie tegen L1-inserties. De TE’s worden het best getolereerd wanneer ze een lage frequentie van insertie bezitten. Er bestaan mechanismen die het springen van de genen onderdrukt. Ze zijn daardoor minder schadelijk en worden doorgegeven van generatie op generatie. De TE’s hebben een grote rol in de evolutie van de mens. De inserties van TE’s, in het bijzonder van de Alu Yb sequenties, zijn de laatste paar miljoen jaar enorm toegenomen. Voor die tijd waren ze heimelijk in het genoom aanwezig en hadden een zeer lage activiteit. Deze activiteit is bij de mens dus erg toegenomen sinds de scheiding van de chimpansee zo’n 6 miljoen jaar geleden. Hoewel de TE’s erg beslissend zijn geweest voor de evolutie van het menselijk genoom kan niet gesteld worden dat ze een voordeel inhouden voor het organisme waar ze deel van uitmaken.

Uit: Nature Reviews Genetics

Dit bericht kwam tot stand naar aanleiding van een blog van Gert Korthof over een artikel in Scientific American betreffende toegenomen activiteit van jumping genes in de hippocampus van rennende muizen. De hypothese werd naar voren gebracht dat jumping genes een varieteit aan neuronen zou kunnen voortbrengen die de mogelijkheid tot leren zou doen toenemen.

Tussen genotype en fenotype; epigenetica

Het genoom of DNA (de sequentie van opeenvolgende basen) van een organisme vormt zijn genotype. Alle informatie voor de ontwikkeling en het functioneren van een organisme liggen er in opgeslagen. Het fenotype daarentegen omvat alle waarneembare kenmerken van een organisme. De kleur van bloemblaadjes of de kleur van de ogen of haren zijn voorbeelden van het fenotype. Maar ook het arsenaal aan proteïnen of mRNA die zich in een cel bevinden bepalen met wat voor cel (een spier- of hersencel bijv.) en dus met wat voor een fenotype we te maken hebben.

Azalea met nieuw fenotype als gevolg van transposons.

Nu ligt niet alle informatie die bepalend is voor het fenotype opgeslagen in het genotype. Er bestaan invloeden van buitenaf die bepalend kunnen zijn voor het fenotype. De epigenetica houdt zich bezig met alles, behalve het genotype, dat invloed heeft op het fenotype. Er bestaan erg veel mechanismen die onder epigenetica vallen. Om er een paar te noemen: de methylatie en de aminozurensequentie van de histonen, de RNAi die bepalend zijn voor het inactiveren van mRNA. Lees ook een voorgaand blog over de moleculaire mechanismen van epigenetica. Deze epigenetische kenmerken lijken ook overgeërfd te kunnen worden. Over dit laatste gegeven wordt nog steeds hevig gediscussieerd, omdat in de gevallen waarin deze epigenetische kenmerken overgeërfd zouden worden er sprake is van slechts enkele generaties. Omdat de epigenetica een zeer uitgebreid veld vormt, kan het onmogelijk in een blogje omschreven worden. Daarom kies ik voor een voorbeeld uit het laatste nieuws waarin een epigenetisch mechanisme planten beschermd tegen mogelijk schadelijk DNA namelijk de transposons.

In de laboratoriumplant Arabidopsis is in een recente studie aangetoond hoe het enzyme HDA6 een belangrijke rol heeft in het proces van ‘gene silencing’ ofwel het onderdrukken van mogelijk schadelijke transposons. Transposons of jumping genes zijn stukken DNA die zich vrij bewegen in het genoom, maar die daar behoorlijk veel schade kunnen aanrichten door bijvoorbeeld midden in een gen te belanden en het functioneren ervan permanent te onderbreken. Het ontdekte enzym bindt de transposons en modificeert de omliggende histonen. Samen met de methyltrasferase MET-1 die het DNA methyleert worden de transposons onderdrukt. Zo wordt het DNA beter ingepakt waardoor de transposons minder makkelijk kunnen verspringen en minder schade aan kunnen richten. Het fenomeen is al langer bekend maar deze studie laat zien welk enzym ervoor verantwoordelijk is.

Voor wie meer wil lezen over epigenetica kan naar het Europese Netwerk over epigenetica surfen. Meer informatie in het Engels is te vinden op het gastblog van Greg Mayer en de verwijzing daarin.

Plaatje van internet.